Количественное определение содержания ионов кальция по измерениям флуоресценции однодлинноволновых красителей с помощью лазерной сканирующей микроскопии
УДК 57.086 + 535.33
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЯМ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ОДНОДЛИННОВОЛНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ
© 2011 г. Ю. Н. Захаров, канд. физ.-мат. наук; А. В. Ершова, студент Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород
Е-mail: zhrv@rf.unn.ru
Рассматривается проблема получения достоверных количественных данных экспериментов при изучении функциональной активности клеток мозга методом флуо ресцентной микроскопии с использованием специфических кальциевых красителей. Разработан метод определения концентрации ионов кальция по текущей интенсивности флуоресценции на одной длине волны исходя из протокола окрашивания и условий возбуждения, исключающий необходимость калибровки в каждом экспер именте.
Ключевые слова: спектроскопия, флуоресценция, флуоресцентная микроскопия, функциональный анализ, анализ клеток, биофотоника.
Коды OCIS: 170.6280, 170.2520, 170.2655, 170.1530, 170.3880
Поступила в редакцию 15.02.2011
Необычайно важная роль метаболизма ионов кальция в жизнедеятельности и функционировании живых организмов в целом и их нервной деятельности, в том числе в когнитивных процессах, вызвала необходимость разработки методов определения концентрации ионов кальция в клетках головного мозга. Одним из наиболее развитых и удобных методов визуализации ионов кальция применительно к нейробиологическим исследованиям является флуоресцентная микроскопия [1]. Метод основан на применении специфических красителей, изменяющих характер флуоресценции в присутствии специфичных этому красителю атомов, молекул или ионов, в данном случае – ионов кальция Ca2+. В зависимости от концентрации Ca2+ может происходить изменение спектральной кривой излучения (так называемые двух длинноволновые красители) или интенсивности флуоресценции при неизменной форме спектра (однодлинноволновые) [2]. Несмотря на широкое распространение этого метода исследование изменения концентрации ионов кальция (кальциевых осцилляций) проводится, как правило, на качественном уровне вследствие отсутствия надежных методов количественного анализа. Двухдлинноволновые красители, в принципе, позволяют однозначно вычислить концентрацию свободных ионов
кальция по отношению интенсивностей излучения красителя на двух различных длинах волн при постоянном возбуждении или по отношению интенсивностей излучения при изменении длины волны возбуждения [2]. Но спектр поглощения этих красителей лежит в ультрафиолетовой области, а ультрафиолетовая накачка вызывает сильную автофлуоресценцию белков, накладывающуюся на информационный спектр, искажая тем самым результаты измерений. Известная формула вычисления концентрации свободных ионов по излучению однодлинноволновых красителей [2] требует апостериорных измерений интенсивности флуоресценции при отсутствии ионов агента Fmin и при насыщении ими Fmax. Это не гарантирует идентичности условий измерения этих величин и текущей интенсивности F, что необходимо для работы формулы [2]. Однако можно получить расчетные соотношения, не требующие такой калибровки после каждого измерения F.
Интенсивность излучения F при наблюдении отдельной ячейки объема V, загруженной флуоресцентным красителем, определяется интенсивностью излучения лазера накачки I0, числом молекул красителя, коэффициентом поглощения красителя α, квантовым выходом красителя QF, числом фотонов, захва-
36 “Оптический журнал”, 78, 10, 2011
ченных оптической системой Φ (количество окраш енного материала, фактически видимого в объектив), и квантовой эффективностью детектора QD
F = ΦQDQFαI0n,
(1)
где n – молярное количество красителя, при-
сутствующего в объеме V. Вводим постоянный
фактор
S = ΦQDQFαI0
(2)
– интенсивность флуоресценции 1 мкМ индикатора. В случае кальциевого индикатора молярное количество nf и nb свободного и связанного с кальцием красителя нужно рассмотреть отдельно. Они отличаются своим квантовым выходом и поглощением, поэтому им соответствуют факторы Sf и Sb. Тогда
F = Sfnf + Sbnb.
(3)
С другой стороны, соотношение между концентрациями свободных ионов кальция [Ca2+]i и красителя, свободного и связанного с ионизо-
ванным кальцием, зависит от константы дис
социации
Kd
=
nf
êéëCa2+ nb
ùúû i
.
(4)
Учитывая, что общее количество красителя
на единицу объема V
Таким образом получена формула, позволяющая вычислять концентрацию ионов кальция по измеряемой интенсивности флуоресценции, выраженной в тех же единицах (на 1 мкМ), что и факторы Sf и Sb, в которые входят характеристики оптической системы микроскопа и его фотодетектора F и QD – величины постоянные и известные для каждого конкретного прибора. Характеристики красителя α, QF и Kd также однозначно определяются видом и формой красителя и растворителем, а общую концентрацию красителя nΣ в измеряемом объеме необходимо выбирать исходя из требуемого диапазона определяемой концентрации ионов кальция и проводить загрузку препарата красителем таким образом, чтобы обеспечить эту заданную величину. При загрузке полярной формы красителя через патч-пипетку это легко сделать, определив объем клетки. При использовании АМ-формы красителя [3] исходят из среднего размера клеток и их плотности, которые либо известны, или определяются отдельно для заданных о бъектов исследования.
В случае, когда необходимо определить общее количество ионов кальция, выделенное в результате какого-либо процесса, формула преобразуется за счет добавления к концентрации свободного кальция концентрации с вязанного (из соотношений (5) и (6))
nΣ = nb + nf,
(5)
выражаем через константу диссоциации (4) [Ca2+]i, умножаем числитель и знаменатель на разность факторов Sb и Sf и, подставляя их соответственно в числитель и знаменатель из
выражения (3) с учетом соотношения (5), по-
лучаем
êëéCa2+ ùúûi =
Kd
nb (Sb nf (Sb
- Sf ) - Sf )
=
Kd
F - SfnΣ SbnΣ - F
.
(6)
ëêéCa2+ úûùtotal
=
Kd
F - SfnΣ SbnΣ - F
+
F - SfnΣ Sb - Sf
.
(7)
Поскольку калибровки всех входящих в выражения (6) и (7) параметров известны из характеристик приборов и индикаторов или могут быть проведены при подготовке эксперимента, эти соотношения позволяют также проводить количественный мониторинг в масштабе реального времени.
* * * * *
Литература
1. Handbook of biological confocal microscopy // Ed. by Pawley J.B. N.Y: Springer, 2006. 985 p.
2. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 3440–3450.
3. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Edition // Ed. by Jonson I., Spence M.T.Z. London: Paperback, 2010. 623 p.
“Оптический журнал”, 78, 10, 2011
37
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЯМ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ОДНОДЛИННОВОЛНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ
© 2011 г. Ю. Н. Захаров, канд. физ.-мат. наук; А. В. Ершова, студент Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород
Е-mail: zhrv@rf.unn.ru
Рассматривается проблема получения достоверных количественных данных экспериментов при изучении функциональной активности клеток мозга методом флуо ресцентной микроскопии с использованием специфических кальциевых красителей. Разработан метод определения концентрации ионов кальция по текущей интенсивности флуоресценции на одной длине волны исходя из протокола окрашивания и условий возбуждения, исключающий необходимость калибровки в каждом экспер именте.
Ключевые слова: спектроскопия, флуоресценция, флуоресцентная микроскопия, функциональный анализ, анализ клеток, биофотоника.
Коды OCIS: 170.6280, 170.2520, 170.2655, 170.1530, 170.3880
Поступила в редакцию 15.02.2011
Необычайно важная роль метаболизма ионов кальция в жизнедеятельности и функционировании живых организмов в целом и их нервной деятельности, в том числе в когнитивных процессах, вызвала необходимость разработки методов определения концентрации ионов кальция в клетках головного мозга. Одним из наиболее развитых и удобных методов визуализации ионов кальция применительно к нейробиологическим исследованиям является флуоресцентная микроскопия [1]. Метод основан на применении специфических красителей, изменяющих характер флуоресценции в присутствии специфичных этому красителю атомов, молекул или ионов, в данном случае – ионов кальция Ca2+. В зависимости от концентрации Ca2+ может происходить изменение спектральной кривой излучения (так называемые двух длинноволновые красители) или интенсивности флуоресценции при неизменной форме спектра (однодлинноволновые) [2]. Несмотря на широкое распространение этого метода исследование изменения концентрации ионов кальция (кальциевых осцилляций) проводится, как правило, на качественном уровне вследствие отсутствия надежных методов количественного анализа. Двухдлинноволновые красители, в принципе, позволяют однозначно вычислить концентрацию свободных ионов
кальция по отношению интенсивностей излучения красителя на двух различных длинах волн при постоянном возбуждении или по отношению интенсивностей излучения при изменении длины волны возбуждения [2]. Но спектр поглощения этих красителей лежит в ультрафиолетовой области, а ультрафиолетовая накачка вызывает сильную автофлуоресценцию белков, накладывающуюся на информационный спектр, искажая тем самым результаты измерений. Известная формула вычисления концентрации свободных ионов по излучению однодлинноволновых красителей [2] требует апостериорных измерений интенсивности флуоресценции при отсутствии ионов агента Fmin и при насыщении ими Fmax. Это не гарантирует идентичности условий измерения этих величин и текущей интенсивности F, что необходимо для работы формулы [2]. Однако можно получить расчетные соотношения, не требующие такой калибровки после каждого измерения F.
Интенсивность излучения F при наблюдении отдельной ячейки объема V, загруженной флуоресцентным красителем, определяется интенсивностью излучения лазера накачки I0, числом молекул красителя, коэффициентом поглощения красителя α, квантовым выходом красителя QF, числом фотонов, захва-
36 “Оптический журнал”, 78, 10, 2011
ченных оптической системой Φ (количество окраш енного материала, фактически видимого в объектив), и квантовой эффективностью детектора QD
F = ΦQDQFαI0n,
(1)
где n – молярное количество красителя, при-
сутствующего в объеме V. Вводим постоянный
фактор
S = ΦQDQFαI0
(2)
– интенсивность флуоресценции 1 мкМ индикатора. В случае кальциевого индикатора молярное количество nf и nb свободного и связанного с кальцием красителя нужно рассмотреть отдельно. Они отличаются своим квантовым выходом и поглощением, поэтому им соответствуют факторы Sf и Sb. Тогда
F = Sfnf + Sbnb.
(3)
С другой стороны, соотношение между концентрациями свободных ионов кальция [Ca2+]i и красителя, свободного и связанного с ионизо-
ванным кальцием, зависит от константы дис
социации
Kd
=
nf
êéëCa2+ nb
ùúû i
.
(4)
Учитывая, что общее количество красителя
на единицу объема V
Таким образом получена формула, позволяющая вычислять концентрацию ионов кальция по измеряемой интенсивности флуоресценции, выраженной в тех же единицах (на 1 мкМ), что и факторы Sf и Sb, в которые входят характеристики оптической системы микроскопа и его фотодетектора F и QD – величины постоянные и известные для каждого конкретного прибора. Характеристики красителя α, QF и Kd также однозначно определяются видом и формой красителя и растворителем, а общую концентрацию красителя nΣ в измеряемом объеме необходимо выбирать исходя из требуемого диапазона определяемой концентрации ионов кальция и проводить загрузку препарата красителем таким образом, чтобы обеспечить эту заданную величину. При загрузке полярной формы красителя через патч-пипетку это легко сделать, определив объем клетки. При использовании АМ-формы красителя [3] исходят из среднего размера клеток и их плотности, которые либо известны, или определяются отдельно для заданных о бъектов исследования.
В случае, когда необходимо определить общее количество ионов кальция, выделенное в результате какого-либо процесса, формула преобразуется за счет добавления к концентрации свободного кальция концентрации с вязанного (из соотношений (5) и (6))
nΣ = nb + nf,
(5)
выражаем через константу диссоциации (4) [Ca2+]i, умножаем числитель и знаменатель на разность факторов Sb и Sf и, подставляя их соответственно в числитель и знаменатель из
выражения (3) с учетом соотношения (5), по-
лучаем
êëéCa2+ ùúûi =
Kd
nb (Sb nf (Sb
- Sf ) - Sf )
=
Kd
F - SfnΣ SbnΣ - F
.
(6)
ëêéCa2+ úûùtotal
=
Kd
F - SfnΣ SbnΣ - F
+
F - SfnΣ Sb - Sf
.
(7)
Поскольку калибровки всех входящих в выражения (6) и (7) параметров известны из характеристик приборов и индикаторов или могут быть проведены при подготовке эксперимента, эти соотношения позволяют также проводить количественный мониторинг в масштабе реального времени.
* * * * *
Литература
1. Handbook of biological confocal microscopy // Ed. by Pawley J.B. N.Y: Springer, 2006. 985 p.
2. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 3440–3450.
3. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Edition // Ed. by Jonson I., Spence M.T.Z. London: Paperback, 2010. 623 p.
“Оптический журнал”, 78, 10, 2011
37