Спектрометр для флуоресцентно-отражательных биомедицинских исследований
УДК 621.391.837.681.3]: [621 + 681: 723
СПЕКТРОМЕТР ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-ОТРАЖАТЕЛЬНЫХ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
© 2013 г. Kang Uk*, Ph. D; Г. В. Папаян**, канд. техн. наук; B. Б. Березин*, канд. техн. наук; Н. Н. Петрищев**, доктор мед. наук; М. М. Галагудза***, доктор мед. наук
*** Korean Electrotechnology Research Institute (KERI), Seoul, Korean Republic
*** Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, *** Санкт-Петербург
*** Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург
*** E-mail: papayan.garry632@gmail.com
Разработан волоконный флуоресцентно-отражательный многоканальный спектрометр, который позволяет проводить широкий круг биомедицинских исследований, в том числе оценивать содержание конечных продуктов гликирования в коже и окислительно-восстановительное состояние различных тканей. Его особенность заключается в возможности одновременной регистрации спектров диффузного отражения и флуоресцентной эмиссии. Возбуждение флуоресценции осуществляется светодиодом, излучающим на длине волны 365 нм. Спектры флуоресценции регистрируются в области 400–750 нм, а спектры отражения – в области 350–750 нм. Сходимость результатов измерений составляет 1,6%. Предложена методика коррекции показания автофлуоресценции кожи, позволившая резко снизить ее зависимость от степени пигментации кожи. Возможности прибора иллюстрируются примерами биомедицинских исследований.
Ключевые слова: флуоресцентная спектроскопия, отражательная спектроскопия, флуоресцентная диагностика, автофлуоресценция.
Коды OCIS: 170.0170, 170.6280, 170.6510, 170.3880, 170.3880, 170.1610, 170.4580
Поступила в редакцию 04.09.2012
Введение
Отражательная и флуоресцентная спектроскопии применяются в биомедицинских исследованиях для решения ряда важных фундам ентальных и прикладных задач [1–7]. При этом их совместное применение позволяет точнее интерпретировать данные и повышает надежность диагностики. Для проведения измерений в реальном времени в условиях in vivo обычно используются многоканальные волоконные спектрометры. В зависимости от решаемой задачи приборы могут обладать различными функциональными возможностями и техническими особенностями.
Примером многофункциональной спектрометрической системы может служить “FastEEM system”, которая использовалась при разработке экспресс-методики диагностики рака шейки матки, основанной на различиях автофлуоресцентных свойств нормаль-
ной и опухолевой ткани [8]. Данная система обеспечивает измерения спектров отражения (380–950 нм), а также спектров флуоресцентной эмиссии (380–700 нм) при различном возбуждении (330–500 нм). Последнее свойство позволяет строить трехмерный спектр возбуждения–эмиссии флуоресценции (excitationemission matrix – EEM), используемый для идентификации флуорофоров и выбора оптимальных условий их регистрации. В этом приборе для измерения спектров флуоресценции и отражения используются различные участки общего волоконного зонда, расположенные по окружности в виде двух концентрических колец. Волокна внутреннего кольца (25 осветительных и 12 приемных) предназначены для флуоресцентных измерений. Их торцы отделены от ткани кварцевым стержнем (длина 15 мм, диаметр 2 мм), осуществляющим гомогенизацию возбуждающего и эмиссионного излучений. В наружном кольце, предназна-
56 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
ченном для измерений отраженного света, волокна приводятся в непосредственный контакт с исследуемой тканью. При этом они сгруппированы таким образом, чтобы обеспечить различное расстояние между источником и приемником излучения (1,1, 2,1 и 3,0 мм). Благодаря этому, а также использованию специальной схемы регистрации на основе матрицы ПЗС обеспечивается возможность одновременного зондирования различных слоев ткани по глубине [8].
Флуоресцентный спектрометр ЛЭСА-01БИОСПЕК (ЗАО “БИОСПЕК”, Россия) позво ляет проводить измерения флуоресцентных спектров при эндоскопическом обследовании [9]. Источником света в нем служат лазеры, излучающие на длинах волн 632,8 или 532 нм. Система оснащена гибким V-образным волоконно-оптическим катетером диаметром 1,8 мм, который вводится в инструментальный канал эндоскопа до контакта с исследуемой поверхностью. Катетер состоит из пучка волокон, в котором центральное волокно служит для доставки излучения к ткани, а окружающие волокна – для передачи флуоресцентного излучения в спектрометр. Для увеличения сигнала без потери разрешения приемные волокна на детекторном конце располагаются в линию, выполняя тем самым функцию входной щели полихроматора. Прибор используется для флуоресцентной диагностики, основанной на оценке содержания эндогенных порфиринов, а также при фотодинамической терапии для контроля накопления тканью фотосенсибилизатора и дозиметрии, основанной на оценке его обесцвечивания при облучении. Аналогичными возможностями обладает спектральнофлуоресцентная диагностическая установка “Спектр-Кластер” (ООО “Кластер”, ИОФ РАН, Россия) [10].
Установка [11] предназначена для интра операционного контроля ишемии миокарда путем оценки окислительно-восстановительного состояния ткани, основанной на флуоресцентных свойствах кофермента NADH. Это вещество в восстановленном состоянии обладает яркой флуоресценцией с максимумом в области 4 50–460 нм и теряет эту способность при переходе в окисленное состояние [12]. В качестве источника возбуждения в установке служит импульсный азотный лазер (337 нм), излучение которого поступает на объект с помощью дихроичного светоделителя и линз сопрягающей оптики. В фокусе линз находятся торцы
двух кварцевых волоконных жгутов. Один из них предназначен для связи с объектом, другой – для связи с многоканальным спектрометром. Детектором излучения в установке является стробируемая камера с усилителем яркости, работа которой синхронизирована с импульсами лазера.
В последнее время внимание многих исследователей все больше привлекает методика измерения спектров автофлуореценции (АФ) кожи, обеспечивающая возможность оценки уровня конечных продуктов гликирования (AGE). Интерес к этим продуктам вызван тем, что накопление AGE происходит в течение всей жизни человека, но особенно активно при действии на организм неблагоприятных факторов (гипергликемия, оксидативный стресс, нарушение экскреторной функции почек). Эта зависимость позволяет использовать AGE в качестве биомаркера ряда тяжелых заболеваний. При возбуждении ультрафиолетовыми (УФ) лучами в области 370 нм AGE излучают флу оресценцию в сине-фиолетовой области спектра с максимумом, соответствующим 440 нм [13]. Поскольку AGE накапливаются во всех тканях, в том числе и в коже, их количество в организме можно оценивать неинвазивным способом. Для проведения таких измерений разработаны специализированные приборы “AGE-Reader” и “SCOUT”.
В приборе “AGE-Reader” (DiagnOptics, Netherlands) (рис. 1) [14] источником возбуждающего излучения служит УФ люминесцентная лампа, излучающая в диапазоне 300–420 нм. Сбор и регистрация излучения осуществляются с помощью волоконного зонда и спектрометра. Для увеличения площадки, на которой осуществляются измерения, проксимальный конец волокна отодвинут на некоторое расстояние от осветительного окна с исследуемым участком ткани, а для снижения вклада зеркального отражения от объекта ось волокна расположена под углом 45° к поверхности окна. Измерения проводятся на участках кожи размером 0,4 см2, расположенных в области предплечья пациента. Для учета влияния пигментации кожи оценивается коэффициент диффузного отражения с помощью светодиода белого свечения. Результат измерения представляется в виде отношения интенсивности АФ (420–600 нм) к интенсивности отраженного возбуждающего излучения (300–420 нм). Продолжительность измерения составляет от 1 до 3 мин в зависимости от цвета кожи.
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
57
5 8 76
4 3 2
1
Рис. 1. Схема, поясняющая принцип действия прибора “AGE-Reader”. 1 – УФ лампа, 2 – светодиод белого свечения, 3 – окно, 4 – кожа предплечья, 5 – измеряемый участок, 6 – волоконный зонд, 7 – спектрометр, 8 – компьютер.
Рис. 2. Прибор “SCOUT”.
С помощью прибора “AGE-Reader” проведен широкий круг исследований [15–20]. В частности, показано, что АФ кожи может служить неинвазивным маркером микроангиопатии у пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа [15], мощным прогностическим фактором сердечно-сосудистой смертности при диабете [16], независимым предиктором оценки качества операции при пересадке почек [17] и др. В клинической практике этот прибор применяется для оценки риска возникновения сердечно-сосудистых осложнений.
Прибор “SCOUT” (VeraLight Inc., USA) предназначен для выявления больных СД [21–23] (рис. 2). Причину создания данного прибора его авторы объясняют тем, что современные методы раннего выявления СД не удовлетво ряют врачей ни по точности постановки диагноза, ни по производительности анализа. Клинические испытания “SCOUT” показали, что измерение АФ кожи обеспечивает более высокую чувствительность (73,7%) по сравнению с принятыми методами скрининга СД, что позволило его авторам рекомендовать прибор в качестве средства для проведения массового обследования населения [23].
В приборе “SCOUT” функцию доставки и сбора света осуществляет оптико-волоконный жгут, включающий в себя три регулярных канала. Волокна первого канала служат для доставки света от источника возбуждающего света, второго канала – для доставки света от источника белого света, а третьего канала – для доставки вторичного излучения кожи на вход спектрометра. В качестве источников света используются светодиоды. Измерения проводятся на участке кожи примерным размером 5×5 мм. Окончательные данные представля-
ются по результатам усреднения трех последовательных измерений. Общая продолжительность измерений составляет 3 мин.
Целью настоящей работы является разработка универсального флуоресцентно-отражательного спектрометра “Skin-AGE”, предназначенного для решения различных биомедицинских задач, в том числе описанных выше.
1. Прибор “Skin-AGE”
1.1. Принцип действия
Для обеспечения универсальности в основу разработанного прибора – медицинского спектрометра “Skin-AGE”, положен способ локальной спектроскопии, осуществленный с помощью волоконного многоканального спектрометра. Известно, что в случае исследования кожи точечные измерения дают большой разброс показаний, обусловленный изменениями локальных оптических свойств ткани.
На рис. 3а показано изменение сигнала флуоресценции, полученное при перемещении волоконного зонда “Skin-AGE” в пределах участка кожи 9,5×13,5 мм, а на рис. 3б – фотография этого же участка в свете собственной флуоресценции, полученная в свете АФ с помощью видеодерматоскопа “EcoSkin” [24]. Их сопоставление показывает, что основной причиной вариации сигнала флуоресценции является неравномерность пигментации кожи. Даже на таком относительно однородном незагорелом участке кожи среднеквадратическое отклонение сигнала (ско) составляет 13%. При
58 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
Интенсивность, усл. ед.
(а) 200
160 120 80 40
00
(б)
20 40 60 80 100 120 140
Время, с
1 мм
Рис. 3. Сигнал флуоресценции незагорелого участка кожи (третий фототип), полученный при его сканировании зондом спектрометра “Skin-AGE” (а), и фотография этого же участка предплечья (9,5×13,5 мм), полученная в свете автофлуоресценции с помощью видеодерматоскопа “EcoSkin” (б).
наличии в зоне измерения загара, пигментных пятен, волосяных фолликулов, волос и других элементов кожи этот разброс может быть значительно выше. Его можно уменьшить почти вдвое, если проводить, как это часто делается, нормировку флуоресценции по отражению (т. е. в качестве измеряемого параметра использовать отношение сигнала флуоресценции к сигналу, полученному в результате отражения возбуждающего излучения). Однако для надежной диагностики этого приема недостаточно.
Радикальным средством улучшения воспроизводимости данных является усреднение показаний на возможно большей площади. При наличии ручного зонда увеличение площади измерения достигается легко при сканировании поверхности кожи. Как будет показано ниже, эта мера вместе с выбором для измерения наиболее однородного участка кожи позволяет получать высокую сходимость результатов. Таким образом, основной методической
особенностью работы прибора “Skin-AGE” при измерениях на коже является использование усредненных данных, полученных в результате ее сканирования на большой площади.
Что касается аппаратных особенностей “Skin-AGE”, то одна из них заключается в быстром периодическом переключении режимов работы прибора с регистрации флуоресценции на регистрацию отражения и обратно. Это позволяет регистрировать оба типа спектров почти одновременно, что в свою очередь сводит до минимума ошибки, связанные с влиянием динамики кровотока.
Другая особенность обусловлена конструкцией зонда. В нем одни и те же волокна используются как при флуоресцентных, так и при измерениях отражения, а их дистальные торцы приводятся в непосредственный контакт с исследуемой поверхностью органа. Такая геометрия освещения и сбора света дает следующие преимущества. Она позволяет, во-первых, устранить зеркальную составляющую отражения, вносящую помеху при измерениях диффузного отражения, во-вторых, сделать идентичными траектории измеряемых флуоресцентных и рассеянных фотонов, что способствует повышению эффективности борьбы с влиянием поглощения кожи на флуоресцентный сигнал и, наконец, в-третьих, зондировать в основном эпидермис и верхний слой дермы, что важно для совместной оценки AGE и NADH.
Для оптимизации выполнения других задач предусмотрена возможность использования зондов иной конструкции.
Наконец, последней особенностью является использование для возбуждения флуоресценции ближней УФ области в диапазоне 360– 370 нм, которая является оптимальной для измерения AGE и NADH и в то же время позволяет измерять спектры флуоресценции многих других веществ, в том числе распространенных фотосенсибилизаторов.
Функциональная схема прибора “Skin-AGE” представлена на рис. 4. Для освещения объекта используется комбинированный осветитель, способный генерировать одновременно широкополосное видимое и УФ излучения. Их объединение в осветительном жгуте осуществляется на принципе углового суммирования излучений от различных источников света [25]. Осветитель включает в себя светодиод УФ свечения с длиной волны 365 нм (NC4U133A, Nichia), который предназначен для возбужде-
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
59
1 11
13 5
6
23 10
12
4 8
9
7
Рис. 4. Функциональная схема прибора “Skin-AGE”. 1 – комбинированный осветитель, 2 – УФ источник возбуждения флуоресценции, 3 – очищающий светофильтр, 4 – сопрягающая оптическая система, 5 – широкополосный источник видимого освета, 6 – Y-образный волоконный зонд, 7 – объект, 8 – блокирующий светофильтр, 9 – спектрометр, 10 – драйвер, 11 – переключатель, 12 – компьютер, 13 – расположение волокон в зонде:
в центре приемное волокно, вокруг – освети-
тельные волокна.
ния флуоресценции, а также расположенные по окружности с наклоном относительно его оптической оси светодиоды (белый, 405, 505, 660 и 730 нм), предназначенные для освещения объекта при измерениях спектров отражения в широком спектральном диапазоне (380– 760 нм).
В переднем фокусе сопрягающей оптической системы находится излучающая поверхность УФ светодиода, а в заднем фокусе – торцы волокон осветительного жгута зонда. Коротковолновый светофильтр применен для очистки УФ излучения от следов видимого света. Мощность УФ излучения на выходе зонда составляет около 5 мВт, что достаточно для записи высококачественных спектров флуоресценции при времени интегрирования порядка 7 мс.
Оси светодиодов 5 расположены под углом 18° относительно оптической оси сопрягающей системы. Этот угол чуть меньше апертурного угла используемого волокна (20,5°), что позволяет только части (около 25%) излучения попасть в его сердцевину. Этого количества, однако, вполне хватает, чтобы получать близкие по значению сигналы флуоресценции и от-
раженного света. Светодиоды питаются драйвером через переключатель, работа которого синхронизирована с работой спектрометра. В режиме одновременных флуоресцентно-отражательных измерений переключение проводится с частотой около 30 Гц, которая достаточна, чтобы отслеживать изменения сигналов при распространении пульсовой волны.
Излучение от источника света поступает на объект через осветительный канал волоконного зонда, состоящего из шести расположенных по периферии одинаковых волокон, а вторичное излучение от объекта поступает в спектрометр по центральному волокну. Таким образом, вместо традиционно используемой геометрии, при которой свет поступает через центральное волокно, а собирается окружающими его волокнами, в данном случае применяется обратная схема. Это позволяет увеличить интенсивность освещения и улучшить сбор света на фотоприемнике. Кварцевые волокна имеют числовую апертуру 0,35 и диаметр сердцевины 400 мкм.
В качестве спектрометра используется коммерчески доступный оптоволоконный спектрометр AvaSpec-2048 (Avantes Inc., Netherlands), построенный на основе полихроматора по симметричной схеме Черни–Тернера с линейным ПЗС в качестве фотоприемника. Прибор имеет 2048 элементов разложения размером 14×56 мкм и обеспечивает одновременную регистрацию спектров в области 330–1100 нм. В “Skin-AGE” из этой области используется диапазон 360–760 нм. С помощью входящей в состав спектрометра микропроцессорной платы проводится цифровое преобразование сигнала, его первичная обработка и передача в компьютер через интерфейс USB 2.0. На входе спектрометра установлен светофильтр, предназначенный для ослабления возбуждающего света, что важно при формировании нормирующего сигнала отражения в УФ области спектра.
Примеры спектров АФ и отражения, полученные у одного и того же человека на участках кожи с разной степенью загара, приведены на рис. 5. Видно, что по мере увеличения загара кривые отражения и флуоресценци смещаются вниз, причем у флуоресцентных спектров эта тенденция проявляется сильнее, чем у спектров отражения. Эти особенности приняты во внимание при выборе условий, снижающих влияние пигментации кожи (см. ниже).
60 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
Интенсивность АФ, усл. ед. R, %
70 760 50 40 30 20 10
0 350
380 400
440
1 2 3 4
56 78
450 500
550 l, нм
Рис. 5. Примеры спектрограмм, записанных прибором “Skin-AGE” на участках кожи (3-й
фототип) с различной степенью загара. Кривые 1–4 – спектры отражения (калибровка по МС-14). Кривые 5–8 – спектры АФ. 1, 5 – кожа без загара, 2, 6 – со слабым загаром, 3, 7 – с умеренным загаром, 4, 8 – с сильным за-
гаром. Пунктирными линиями показаны цен-
тры аналитических длин волн (380 и 440 нм)
при измерении AGE.
(а) (б)
1.2. Конструкция
Разработаны экспериментальные образцы прибора в двух вариантах исполнения – с внешним компьютером (а), со встроенным компьютером и дисплеем типа “touch screen” (б). Их внешний вид представлен на рис. 6. Запуск процесса измерения в первом варианте осуществляется с помощью кнопки, расположенной на дистальном конце зонда, а во втором – с помощью педали, подключенной непосредственно к прибору.
1.3. Стандарты и калибровка
Измерение флуоресцентных спектров проводится в радиометрическом режиме (“Irradiance Mode”), который позволяет записывать исправленные спектры флуоресценции в единицах спектральной плотности мощности излучения (мкВт/см2/нм) и получать результаты, не зависимые от времени интегрирования сигнала. Для этого прибор вместе с зондом проходит предварительную калибровку с помощью образцового источника “AvaLight-DH-Cal” (Avantes Inc., Netherlands). Периодический контроль и корректировка спектральных коэффициентов осуществляются с помощью флуоресцентного стандарта “USFS-200” (Labsphere Inc., USA).
Калибровка прибора в режиме отражения проводится с помощью пластины из молочно-
Рис. 6. Внешний вид экспериментальных образцов спектрометров “Skin-AGE” с внешним компьютером (a), со встроенным компьютером (б).
го стекла МС-14, приводимой в контакт с зондом. Спектры отражения кожи, показанные на рис. 5, заметно отличаются от измеренных с помощью интегрирующей сферы с калибровкой по стандартным образцам диффузного отражения [26]. Главное отличие состоит в бо′льших значениях коффициентов диффузного отражения в синей области спектра. Объясняется это главным образом различиями геометрии освещения и сбора света. Для целей диагностики эти различия несущественны. Наоборот свойственная “Skin-AGE” особенность регистрации спектра диффузного отражения с помощью того же зонда, что и спектра флуоресценции, способствует более эффективному устранению влияния пигментации
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
61
кожи. Если же требуются более правильные, с точки зрения метрологии, спектры диффузного отражения, то вместо волоконного зонда нужно использовать интегрирующую сферу, например “AvaSphere-30-REFL” (Avantes Inc., Netherlands), а в качестве образца сравнения – стандарт диффузного отражения “WS-2” (Labsphere Inc., USA).
2. Методика измерения на примере оценки AGE в коже
2.1. Выбор места и условий измерения
Предварительные исследования для выбора оптимального места измерения проводились на различных участках кожи (подушечка пальцев, ладонь, запястье, плечо, предплечье, локтевой сгиб, колено, голень, лодыжка) при вариациях ряда параметров измерений (площадь и время сканирования, давление на кожу и пр.).
Измерения показали, что все участки обладают статистически значимыми различиями средних величин. Более того, различия до 10% могут наблюдаться даже на идентичных у частках тела, расположенных с левой или с правой стороны. Поэтому для получения сопоставимых результатов необходимо не только зафиксировать место, но и сторону измерения (или пользоваться усредненными данными симметричных участков слева и справа). Наибольшую стабильность показаний дали измерения на коже медиальной поверхности плеча. При этом была получена сходимость результатов 1,6%. Измерения проводились в следующих условиях: регистрируемый параметр АФ – AF = F(440)/R(380), объект – незагорелый участок кожи 3-го фототипа, время от момента калибровки до конца измерения не более 30 мин, продолжительность сканированиях 3–5 с, площадь сканирования – 3–10 см2, спектральные условия регистрации сигналов – 380 ± 10 нм и 440 ± 10 нм.
2.2. Выбор условий снижающих влияние пигментации кожи
Различный характер пигментации кожи может существенно дестабилизировать результаты измерений AGE, когда сравниваются данные, полученные у людей с разными цветом кожи или степенью загара.
Для уменьшения этого эффекта предложен ряд корректирующих технологий [27]. Как
указывалось выше, в приборе “AGE-Reader” результат измерения представляется в виде нормализованной на отражение интенсивности АФ. Такой коррекции оказалось недостаточно для проведения измерений у людей с разным цветом кожи [28]. Для снижения этого влияния предложено использовать корректирующую функцию, рассчитываемую из спектров отражения, которая дала для европеоидной группы снижение разброса АФ с 20 до 14,8% ско [28].
В приборе “SCOUT” для коррекции используют другой подход, основанный на применении следующей эмпирической формулы [22]:
fxm = Fxm/(RxkxRmkm),
(1)
где Fxm – измеренный сигнал флуоресценции, fxm – скорректированный сигнал флуоресценции, Rx и Rm – коэффициенты отражения на длинах волн возбуждении и эмиссии, kx и km – показатели степени, устанавливаемые эмпирическим способом.
В настоящей работе были опробованы различные условия измерения и способы коррекции, позволяющие учесть потери света внутри ткани, вызванные поглощением и рассея нием фотонов при возбуждении и эмиссии. Они, в частности, показали, что при выборе длин волн, на которых осуществляются оценки ф луоресценции и отражения, желательно их устанавливать на спектральных участках с близкими значениями коэффициентов отражения. Как указывалось выше, максимум эмиссионного спектра AGE находится на длине волны 440 нм. Ближайшей точкой области возбуждения со сходным значением коэффициента отражения является 380 нм (рис. 5). Эти длины волн были выбраны в качестве аналитических.
В качестве функции корректированной флуоресценции исследовались различные зависимости. Наилучшие результаты были получены с формулой
AF = F(440)/[R(380)k1 + аR(440)k2], (2)
где F(440), R(380) и R(440) – соответственно флуоресцентный сигнал и отраженные сигналы на аналитических длинах волн, k1 и k2 и а – константы, устанавливаемые по резуль татам экспериментов.
Для подбора констант, обеспечивающих лучшую коррекцию, проводились исследования кожи одного и того же человека на участках с различной ее пигментацией. Такой ме-
62 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
тодический подход, по сравнению с измерениями кожи с различным цветом [29], существенно упрощает и ускоряет подбор оптимальных констант. Результаты одного из наших экспериментов, в котором измерения проводились на 4-х участках кожи плеча с разной степенью загара, представлены в табл. 1 и на рис. 7. Максимальные перепады флуоресцентного сигнала, вызванные различной пигментацией кожи, превышали 10 раз. Номера вариантов с различными значениями констант формулы (2) показаны в первом столбце табл. 1, а получаемый при этом разброс значений скорректированной АФ DAF – в последнем столбце т аблицы.
Из представленных данных видно, что отсутствие коррекции (вариант 1) приводит к наихудшим результатам. Разброс сигналов флуоресценции в этом случае для всех зон кожи с различной пигментацией составил 60,6% (ско). Намного лучше (18,3%) обстоит дело, когда в качестве измеряемого параметра используется отношение флуоресцентного сигнала к сигналу отражения в области возбуждения F(440)/R(380) (вариант 2). При слабой пигментации (R(380) > 40%) разброс составляет 1,6%. При использовании экспоненциальной функции F(440)/R(380)0,85 (вариант 3) аналогичный результат может быть достигнут при R(380) > 15–20%. Для того чтобы коррекция была эффективной во всем диапазоне возможных отражений (R(380) = 5–60%),
Таблица 1. Коррекция влияния пигментации кожи с помощью формулы (2) при различных зна-
чениях констант k1 и k2 и а
№ кривой k1
k2
а DAF(ско), %
1 0 0—
2 1 0—
3
0,85
0
—
4
0,40 0,54
0,5
60,6 18,3 5,6 1,1
Интенсивность АФ (440 нм), усл. ед.
1,4 4
1,2
1
0,8
0,6
Cн
0,4
3
2
Cр 1
Cл
Б
0,2
0 0 10 20 30 40 50 60
R (380 нм), %
Рис. 7. Результаты измерений АФ кожи при различных значениях констант k1 и k2 и а на медиальной части плеча на участках с различной степенью загара: без загара (Б), со слабым (Сл), средним (Ср) и сильным (Сн) загаром. Условия регистрации кривых 1–4 соответствуют значениям, приведенным в табл. 1.
требуется использовать данные об отражении также и на длине волны эмиссии. При подстановке в формулу (2) констант k1 = 0,4, k2 = 0,54, а = 0,5 (вариант 4) ско параметра AF в этом случае составило 1,1%. Таким образом, применение формулы (2) с указанными константами позволяет уменьшить вариацию AF по сравнению с полным отсутствием коррекции почти в 60 раз.
3. Примеры исследований
3.1. Оценка AGE в норме, при диабете и почечной недостаточности [28]
Контингент обследованных лиц состоял из четырех групп: практически здоровые мужчины и женщины (контроль), больные СД, пациенты с трансплантированной почкой (ТП), больные с хронической почечной недостаточностью (ХПН), находящиеся на программном гемодиализе.
Результаты измерений представлены в табл. 2. Значения АF получены путем коррек-
Таблица 2. Результаты исследований АФ кожи у здоровых лиц и при различной патологии
Группа
n Средний возраст (диапазон) AF (среднее/ско, %) Коррелляция с возрастом, %
контроль СД ТП гемодиализ при ХПН
47 20 21 81
38 (16–78) 56,1 (29–82) 43,5 (15–62) 53,4 (22–82)
1,00/14 1,22/11 1,33/20 1,56/29
74 60 53 14
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
63
ции данных по возрастной зависимости для контрольной группы и нормированы по отношению к ее среднему значению. Разброс данных внутри каждой группы указан в ско. Наибольшее увеличение АФ (1,56 ± 0,29) наблюдалось у больных с ХПН, находящихся на гемодиализе. Корреляция с возрастом у них практически отсутствует. Образование AGE при ХПН связано с прямым взаимодействием реактивных карбонильных групп с аминогруппами белков (карбонильный и оксидативный стрессы). Больные с ТП демонстрируют меньшую АФ по сравнению с ХПН (1,33 ± 0,20), что может свидетельствовать о процессе нормализации AGE после пересадки почки. Корреляция с возрастом у них занимает промежуточное положение между ХПН, контролем и СД (53%).
Что касается группы больных СД, то превышение АФ над нормой в среднем составило 22% при разбросе внутри группы 11%. Если за границу нормы принять значение 1,09, то чувствительность (Se) и специфичность (Sp) диагностики диабета по данным этой небольшой по численности выборки составила бы, соответственно, Se = 0,81 и Sp = 0,87.
Проведенные исследования показали удобство применения прибора в клинических условиях (рис. 8) и подтвердили известные из литературы закономерности изменения AGE в норме, а также при некоторых заболеваниях.
мии/реперфузии. Первые два интервала ишемии (каждый из них по 5 мин) использовались для достижения эффекта прекондиционирования, третий 10-мин цикл – для оценки полученного эффекта. Как видно из графика, индекс ишемии в третьем цикле уменьшился по сравнению с первым примерно на 20%, что свидетельствует о перестройке метаболических процессов в миокарде и достижении эффекта прекондиционирования.
Полученные результаты указывают на следующие возможные применения разработанного прибора в клинической практике: интраоперационный мониторинг адекватности защиты миокарда при проведении кардиоплегии, осуществление интраоперационной оценки адекватности перфузии миокарда в зоне реваскуляризации, оценка состояния сердца в момент изъятия у донора и перед проведением трансплантации.
3.2. Мониторинг NADH флуоресценции при ишемии/реперфузии сердца [30]
Целью исследования было изучение динамики АФ сердца в процессе выполнения повторных эпизодов кратковременной ишемии и реперфузии, известных под названием прекондиционирование (адаптивный феномен, заключающийся в повышении резистентности миокарда к последующей продолжительной ишемии). Опыты осуществлялись на изолированном перфузируемом по Лангендорфу сердце крысы. Измерения проводились на приборе “Skin-AGE” в режиме непрерывной регистрации интегральной интенсивности флуоресценции в максимуме эмиссии NADH на длине волны 450 ± 10 нм при возбуждении излучением длиной волны 365 нм. Щуп при регистрации находился в постоянном контакте с работающим сердцем.
На рис. 9 приведены результаты измерения в процессе выполнения трех циклов ише-
64
Индекс ишемии
Рис. 8. Проведение измерений АФ кожи у больных с ХПН с помощью прибора “Skin-
AGE” в Центре гемодиализа городской боль-
ницы № 31 Петербурга.
100
80
60
40
20 0
ишемия
реперфузия
0 500
1000
I цикл II цикл
1500 2000Время, с III цикл
Рис. 9. Изменения сигнала АФ изолированного сердца во времени, обусловленные измене-
нием концентрации NADH при циклической
тотальной ишемии/реперфузии.
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
3.3. Оценка АФ кожи при длительных регулярных наблюдениях
Цель наблюдений заключалась в проверке стабильности данных измерений АФ кожи при их регулярном проведении в течение длительного времени у одного и того же человека. Причина вариации показаний могла иметь техническую и биологическую природу. При регулярных измерениях (по 7–10 раз в день в определенном месте кожи в течение 58 суток) были выявлены обе составляющие. Приборная нестабильность объяснялась изменением температуры спектрометра в процессе его разогрева. Устранение этой причины позволило выявить статистически значимые отклонения в течение дня, связанные с изменением физиологического состояния организма.
Как видно из диаграммы, представленной на рис. 10, максимальные значения АФ наблюдаются в середине рабочего дня после обеда, а также при кратковременной физической нагрузке. При этом было замечено, что в отдельные особо напряженные рабочие дни, сопровождавшиеся изменением привычного ритма жизни, показания увеличивались на 17% относительно среднего уровня. Минимальные значения регистрировались ранним утром по окончании сна и после приема душа.
Причина таких изменений, по-видимому, связана с изменением уровня NADH в коже в течение дня. Как отмечалось выше, этот уровень зависит от окислительно-восстанови-
после сна после зарядки
после душа после завтрака
до обеда после обеда перед ужином после ужина перед сном
0,9 0,92 0,94 0,96 0,98 1,00 1,02 1,04 1,06
Рис. 10. Результаты регулярных измерений АФ кожи на внутренней стороне плеча у мужчины 70 лет в течение 58 суток. Измеряемый параметр – AF = F(440)/R(380). Показаны средние значения АФ, измеренные при идентичных событиях в течение дня. Горизонтальными линиями показаны доверительные интервалы средних значений при уровне значимости a = 0,05.
тельного состояния ткани и при недостатке кислорода в ткани АФ увеличивается. Для объяснения наблюдаемых закономерностей следует предположить, что в течение дня уровень насыщения кожи кислородом может существенно изменяться, что в свою очередь приводит к смещению равновесной реакции NAD+ ↔ NADH либо в сторону восстановления, либо окисления. Физическая нагрузка, утомление в течение рабочего дня способны сдвинуть состояние ткани в сторону восстановления и, наоборот, длительный отдых и водно-ги гиенические процедуры, способствующие насыщению ткани кислородом, – в сторону окисления. В случае подтверждения описанных эффектов можно рассчитывать на еще одно клиническое применение разработанного прибора, а именно, объективную оценку окислительно-восстановительного состояния организма в норме и при различных патологиях путем мониторинга NADH–АФ кожи.
Заключение
Прибор “Skin-AGE” позволяет решать ши рокий круг биомедицинских задач путем измерения спектров флуоресцентной эмиссии и диффузного отражения. С помощью волоконного щупа возможен доступ к различным участкам поверхности функционирующих органов, в том числе кожи.
Для возбуждения флуоресценции используется излучение с длиной волны 365 нм, которое подходит для возбуждения многих эндогенных и экзогенных флуорофоров, в том числе AGE и NADH, а также распространенных порфириновых и хлориновых фотосенсибилизаторов. Эффективное освещение и сбор света позволяют регистрировать спектры флуоресценции и отражения при времени накопления, не превышающем 10 мс. Благодаря практически одновременному измерению обоих типов спектров удается уменьшить влияние динамической компоненты ошибки.
Для снижения влияния пигментации на флуоресцентный сигнал разработан метод, позволяющий значительно уменьшить погрешность, вызванную изменениями концентрации меланина.
Особое внимание в работе уделено условиям получения стабильных результатов измерений, поскольку в задачах флуоресцентной диагностики, основанных на AGE и NADH, изменения обычно невелики и могут легко потонуть
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
65
в шумах, имеющих как биологическую, так и техническую природу. Принятые аппаратнометодические меры позволяют регистрировать небольшие изменения АФ кожи, что повышает надежность существующих методов диагностики и позволяет разрабатывать принци пиально новые.
Возможности прибора проиллюстрированы проведенными с его помощью биомедицинскими исследованиями. В одном из них были обнаружены закономерные изменения АФ в течение суток. Этот феномен может быть использован при разработке объективной методики для оценки степени утомления организма. Кроме того, его нужно принимать во внимание для стабилизации показаний при оценке AGE кожи.
Для дальнейшего расширения возможностей прибора в следующих его модификациях предполагается увеличить число длин волн возбуждения до 5.
Авторы благодарят проф. А.М. Есаяна, проф. Е.Н. Гриневу, Е.А. Трофимову, М.В. Вадюхину и А.Н. Нимгирову за организацию и участие в проведении клинических исследований по оценке AGE в норме, при диабете и почечной недостаточности.
Авторы также выражают благодарность Сеульскому городскому правительству и Сеульскому институту развития за поддержку данной работы в рамках международной программы “Inviting & Supporting Project of Global Leading Institutions” (funds WR100001 for Russian Science Seoul).
* * * * *
ЛИТЕРАТУРА
1. Оптическая биомедицинская диагностика. Т. 2 / Под ред. Тучина В.В. М.: Физматлит, 2007. 368 с.
2. Richards-Kortum R., Sevick-Muraca E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis // Annu. Rev. Phys. Chem. 1996.V. 47. P. 555–606.
3. Papayan G.V., Barsky I.Ya. Contact Luminescence spectrophotometry for biomedical studies // Proc. SPIE. 2001. V. 4515. P. 125–136.
4. Shahzad A., Koehler G. Fluorescence spectroscopy: An emerging excellent diagnostic tool in Medical Sciences // The Internet Journal of Medical Technology. 2010. V. 5. № 1.
5. Ramanujam N., Mitchell M.F., Mahadevan A., Thomsen S., Silva E., Richards-Kortum R. Fluorescence spectroscopy: A diagnostic tool for cervical intraepithelial neoplasia // Gynecol. Oncol. 1994. V. 52. P. 31–38.
6. Mitchell M., Cantor S.B., Brookner C., Utzinger U., Schottenfeld D. Fluorescence spectroscopy for diagnosis of squamous intraepithelial lesions of the cervix // Obstet. Gynecol. 1999. V. 93. № 3. P. 462–470
7. Chang S.K., Mirabal Y.N., Atkinson E.N., Cox D., Malpica A., Follen M., Richards-Kortum R. Combined reflectance and fluorescence spectroscopy for in vivo detection of cervical pre-cancer // Journal of Biomedical Optics. 2005. V. 10. № 2. P. 024031-1–024031-11.
8. Zuluaga A., Utzinger U., Durkin A., Fuchs H., Gillenwater A., Jacob R., Kemp B., Fan J., Richards-Kortum R. Fluorescence excitation-emission matrices of human tissue: a system for in vivo measurement and data analysis // Appl. Spectrosc. 1999. V. 53. P. 302–311.
9. Loschenov V.B., Konov V.I., Prokhorov A.M. Photodynamic therapy and fluorescence diagnostics // Laser Physics. 2000. V. 10. № 6. P. 1188–1207.
10. Zharkova N.N., Kozlov D.N., Polivanov Yu.N., Pykhov R.L., Smirnov V.V. Laser-excited fluorescence spectrometric system for tissue diagnostics // Proc. SPIE. 1994. V. 2328. P. 196–201.
11. Horvath K.A., Schomacker K.T., Lee C.C., Cohn L.H. Intraoperative myocardial ischemia detection with laserinduced fluorescence // J. Thorac. Cardiovasс. Surg. 1994. V. 107. P. 220–225.
12. Mayevsky A., Rogatsky G.G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies // Am. J. Physiol. Cell. 2007. V. 292. P. 615–640.
13. Beránek M., Nováková D., Rozsíval P., Drsata J., Palicka V. Glycation and advanced glycation end-products in laboratory experiments in vivo and in vitro // Acta medica (Hradec Kralove). 2006. V. 49. № 1. P. 35–39.
14. Graaff R., Meerwaldt R., Lutgers H., Baptist R., de Jong E., Andries T., Smit L., Rakhorst G. Instrumentation for the measurement of autofluorescence in human skin // Proc. SPIE. 2005. V. 5692. P. 111–118.
66 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
15. Lutgers H.L., Graaff R., Links T.P., Ubink-Veltmaat L.J., Bilo H.J., Gans R.O., Smit A.J. Skin autofluorescence as a noninvasive marker of vascular damage in patients with type 2 diabetes // Diabetes Care. 2006. V. 29. № 12. P. 2654–2659.
16. Meervaldt R., Lutgers H.L., Links T.P., Graaff R., Baynes J.W., Gans R., Smit A.J. Skin AF is a strong predictor of cardiac mortality in Diabetes // Diabetes Care. 2007. V. 30. P. 107–112.
17. Hartog J.W, Gross S., Oterdoom L.H., van Ree R.M., de Vries A.P., Smit A.J., Schouten J.P., Nawroth P.P., Gans R.O., van Son W.J., Bierhaus A., Bakker S.J. Skin autofluorescence is an independent predictor of graft loss in renal transplant recipients // Transplantation. 2009. V. 87. № 7. P. 1069–1077.
18. Meerwaldt R., Links T.P., Graaff R., Hoogenberg K., Lefrandt J.D., Baynes J.W., Gans R.O., Smit A.J. Increased accumulation of skin advanced glycation end-products precedes and correlates with clinical manifestation of diabetic neuropathy // Diabetologia. 2005. V. 48. P. 1637–1644.
19. Goldin A., Beckman J.A., Schmidt A.M., Creager M.A. Advanced glycation end products sparking the development of diabetic vascular injury // Circulation. 2006. V. 114. P. 597–605.
20. Meerwaldt R., Hartog J.W., Graaff R., Huisman R.J., Links T.P., den Hollander N.C., Thorpe S.R., Baynes J.W., Navis G., Gans R.O., Smit A.J. Skin autofluorescence, a measure of cumulative metabolic stress and advanced glycation end products mortality in hemodialysis patients // J. Am. Soc. Nephrol. 2005. V. 16. P. 3687–3693.
21. Ediger M.N., Johnson R.D., Hull E.L., Brown C.D. Determination of a measure a glycation end-products or disease state using tissue fluorescence // Patent US. № 8078243. 2011.
22. Hull E., Ediger M., Unione A., Deemer E., Stroman M., Baynes J. Noninvasive, optical detection of diabetes: model studies with porcine skin // Opt. Exp. 2004. V. 12. P. 4496–4510.
23. Maynard J.D., Rohrscheib M., Way J.F., Nguyen C.M., Ediger M.N. Noninvasive type 2 diabetes screening, superior sensitivity to fasting plasma glucose and A1C // Diabetes Care. 2007. V. 30. P. 1120–1124.
24. Kang Uk, Папаян Г.В., Bae Soo-Jin, Березин В.Б., Ким С. Флуоресцентный видеодерматоскоп // Оптический журнал. 2008. Т. 75. № 1. С. 32–38.
25. Kang Uk, Папаян Г.В., Макаров Д.А., Lee Seung Yup, Bae Su Jin. Осветитель для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики со световодным выводом излучения // Оптический журнал. 2008. Т. 75. № 12. С. 16–22.
26. Kim O., McMurdy J., Lines C., Duffy S., Crawford G., Alber M. Reflectance spectrometry of normal and bruised human skins: experiments and modeling // Physiol. Meas. 2012. V. 33. P. 159.
27. Bradley R.S., Thorniley M.S. A review of attenuation correction techniques for tissue fluorescence // J. R. Soc. Interface. 2006. V. 3. P. 1–13.
28. Koetsier M., Nur E., Chunmao H., Lutgers H.L., Links T.P., Smit A.J., Rakhorst G., Graaff R. Skin color independent assessment of aging using skin autofluorescence // Opt. Exp. 2010. V. 18. № 14. P. 14416–14429.
29. Петрищев Н.Н., Папаян Г.В., Есаян А.М., Гринева Е.Н., Kang Uk. Исследование конечных продуктов гликирования методом флуоресцентной спектроскопии кожи. Фотодинамическая терапия и флуоресцентная диагностика // Сб. научных трудов / Под ред. Петрищева Н.Н. СПб.: Лань, 2011. С. 222–230.
30. Петрищев Н.Н., Папаян Г.В. Автофлуоресцентная органоскопия. Фотодинамическая терапия и флуоресцентная диагностика // Сб. научных трудов / Под ред. Петрищева Н.Н. СПб.: Лань, 2011. С. 261–273.
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
67
СПЕКТРОМЕТР ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-ОТРАЖАТЕЛЬНЫХ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
© 2013 г. Kang Uk*, Ph. D; Г. В. Папаян**, канд. техн. наук; B. Б. Березин*, канд. техн. наук; Н. Н. Петрищев**, доктор мед. наук; М. М. Галагудза***, доктор мед. наук
*** Korean Electrotechnology Research Institute (KERI), Seoul, Korean Republic
*** Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, *** Санкт-Петербург
*** Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург
*** E-mail: papayan.garry632@gmail.com
Разработан волоконный флуоресцентно-отражательный многоканальный спектрометр, который позволяет проводить широкий круг биомедицинских исследований, в том числе оценивать содержание конечных продуктов гликирования в коже и окислительно-восстановительное состояние различных тканей. Его особенность заключается в возможности одновременной регистрации спектров диффузного отражения и флуоресцентной эмиссии. Возбуждение флуоресценции осуществляется светодиодом, излучающим на длине волны 365 нм. Спектры флуоресценции регистрируются в области 400–750 нм, а спектры отражения – в области 350–750 нм. Сходимость результатов измерений составляет 1,6%. Предложена методика коррекции показания автофлуоресценции кожи, позволившая резко снизить ее зависимость от степени пигментации кожи. Возможности прибора иллюстрируются примерами биомедицинских исследований.
Ключевые слова: флуоресцентная спектроскопия, отражательная спектроскопия, флуоресцентная диагностика, автофлуоресценция.
Коды OCIS: 170.0170, 170.6280, 170.6510, 170.3880, 170.3880, 170.1610, 170.4580
Поступила в редакцию 04.09.2012
Введение
Отражательная и флуоресцентная спектроскопии применяются в биомедицинских исследованиях для решения ряда важных фундам ентальных и прикладных задач [1–7]. При этом их совместное применение позволяет точнее интерпретировать данные и повышает надежность диагностики. Для проведения измерений в реальном времени в условиях in vivo обычно используются многоканальные волоконные спектрометры. В зависимости от решаемой задачи приборы могут обладать различными функциональными возможностями и техническими особенностями.
Примером многофункциональной спектрометрической системы может служить “FastEEM system”, которая использовалась при разработке экспресс-методики диагностики рака шейки матки, основанной на различиях автофлуоресцентных свойств нормаль-
ной и опухолевой ткани [8]. Данная система обеспечивает измерения спектров отражения (380–950 нм), а также спектров флуоресцентной эмиссии (380–700 нм) при различном возбуждении (330–500 нм). Последнее свойство позволяет строить трехмерный спектр возбуждения–эмиссии флуоресценции (excitationemission matrix – EEM), используемый для идентификации флуорофоров и выбора оптимальных условий их регистрации. В этом приборе для измерения спектров флуоресценции и отражения используются различные участки общего волоконного зонда, расположенные по окружности в виде двух концентрических колец. Волокна внутреннего кольца (25 осветительных и 12 приемных) предназначены для флуоресцентных измерений. Их торцы отделены от ткани кварцевым стержнем (длина 15 мм, диаметр 2 мм), осуществляющим гомогенизацию возбуждающего и эмиссионного излучений. В наружном кольце, предназна-
56 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
ченном для измерений отраженного света, волокна приводятся в непосредственный контакт с исследуемой тканью. При этом они сгруппированы таким образом, чтобы обеспечить различное расстояние между источником и приемником излучения (1,1, 2,1 и 3,0 мм). Благодаря этому, а также использованию специальной схемы регистрации на основе матрицы ПЗС обеспечивается возможность одновременного зондирования различных слоев ткани по глубине [8].
Флуоресцентный спектрометр ЛЭСА-01БИОСПЕК (ЗАО “БИОСПЕК”, Россия) позво ляет проводить измерения флуоресцентных спектров при эндоскопическом обследовании [9]. Источником света в нем служат лазеры, излучающие на длинах волн 632,8 или 532 нм. Система оснащена гибким V-образным волоконно-оптическим катетером диаметром 1,8 мм, который вводится в инструментальный канал эндоскопа до контакта с исследуемой поверхностью. Катетер состоит из пучка волокон, в котором центральное волокно служит для доставки излучения к ткани, а окружающие волокна – для передачи флуоресцентного излучения в спектрометр. Для увеличения сигнала без потери разрешения приемные волокна на детекторном конце располагаются в линию, выполняя тем самым функцию входной щели полихроматора. Прибор используется для флуоресцентной диагностики, основанной на оценке содержания эндогенных порфиринов, а также при фотодинамической терапии для контроля накопления тканью фотосенсибилизатора и дозиметрии, основанной на оценке его обесцвечивания при облучении. Аналогичными возможностями обладает спектральнофлуоресцентная диагностическая установка “Спектр-Кластер” (ООО “Кластер”, ИОФ РАН, Россия) [10].
Установка [11] предназначена для интра операционного контроля ишемии миокарда путем оценки окислительно-восстановительного состояния ткани, основанной на флуоресцентных свойствах кофермента NADH. Это вещество в восстановленном состоянии обладает яркой флуоресценцией с максимумом в области 4 50–460 нм и теряет эту способность при переходе в окисленное состояние [12]. В качестве источника возбуждения в установке служит импульсный азотный лазер (337 нм), излучение которого поступает на объект с помощью дихроичного светоделителя и линз сопрягающей оптики. В фокусе линз находятся торцы
двух кварцевых волоконных жгутов. Один из них предназначен для связи с объектом, другой – для связи с многоканальным спектрометром. Детектором излучения в установке является стробируемая камера с усилителем яркости, работа которой синхронизирована с импульсами лазера.
В последнее время внимание многих исследователей все больше привлекает методика измерения спектров автофлуореценции (АФ) кожи, обеспечивающая возможность оценки уровня конечных продуктов гликирования (AGE). Интерес к этим продуктам вызван тем, что накопление AGE происходит в течение всей жизни человека, но особенно активно при действии на организм неблагоприятных факторов (гипергликемия, оксидативный стресс, нарушение экскреторной функции почек). Эта зависимость позволяет использовать AGE в качестве биомаркера ряда тяжелых заболеваний. При возбуждении ультрафиолетовыми (УФ) лучами в области 370 нм AGE излучают флу оресценцию в сине-фиолетовой области спектра с максимумом, соответствующим 440 нм [13]. Поскольку AGE накапливаются во всех тканях, в том числе и в коже, их количество в организме можно оценивать неинвазивным способом. Для проведения таких измерений разработаны специализированные приборы “AGE-Reader” и “SCOUT”.
В приборе “AGE-Reader” (DiagnOptics, Netherlands) (рис. 1) [14] источником возбуждающего излучения служит УФ люминесцентная лампа, излучающая в диапазоне 300–420 нм. Сбор и регистрация излучения осуществляются с помощью волоконного зонда и спектрометра. Для увеличения площадки, на которой осуществляются измерения, проксимальный конец волокна отодвинут на некоторое расстояние от осветительного окна с исследуемым участком ткани, а для снижения вклада зеркального отражения от объекта ось волокна расположена под углом 45° к поверхности окна. Измерения проводятся на участках кожи размером 0,4 см2, расположенных в области предплечья пациента. Для учета влияния пигментации кожи оценивается коэффициент диффузного отражения с помощью светодиода белого свечения. Результат измерения представляется в виде отношения интенсивности АФ (420–600 нм) к интенсивности отраженного возбуждающего излучения (300–420 нм). Продолжительность измерения составляет от 1 до 3 мин в зависимости от цвета кожи.
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
57
5 8 76
4 3 2
1
Рис. 1. Схема, поясняющая принцип действия прибора “AGE-Reader”. 1 – УФ лампа, 2 – светодиод белого свечения, 3 – окно, 4 – кожа предплечья, 5 – измеряемый участок, 6 – волоконный зонд, 7 – спектрометр, 8 – компьютер.
Рис. 2. Прибор “SCOUT”.
С помощью прибора “AGE-Reader” проведен широкий круг исследований [15–20]. В частности, показано, что АФ кожи может служить неинвазивным маркером микроангиопатии у пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа [15], мощным прогностическим фактором сердечно-сосудистой смертности при диабете [16], независимым предиктором оценки качества операции при пересадке почек [17] и др. В клинической практике этот прибор применяется для оценки риска возникновения сердечно-сосудистых осложнений.
Прибор “SCOUT” (VeraLight Inc., USA) предназначен для выявления больных СД [21–23] (рис. 2). Причину создания данного прибора его авторы объясняют тем, что современные методы раннего выявления СД не удовлетво ряют врачей ни по точности постановки диагноза, ни по производительности анализа. Клинические испытания “SCOUT” показали, что измерение АФ кожи обеспечивает более высокую чувствительность (73,7%) по сравнению с принятыми методами скрининга СД, что позволило его авторам рекомендовать прибор в качестве средства для проведения массового обследования населения [23].
В приборе “SCOUT” функцию доставки и сбора света осуществляет оптико-волоконный жгут, включающий в себя три регулярных канала. Волокна первого канала служат для доставки света от источника возбуждающего света, второго канала – для доставки света от источника белого света, а третьего канала – для доставки вторичного излучения кожи на вход спектрометра. В качестве источников света используются светодиоды. Измерения проводятся на участке кожи примерным размером 5×5 мм. Окончательные данные представля-
ются по результатам усреднения трех последовательных измерений. Общая продолжительность измерений составляет 3 мин.
Целью настоящей работы является разработка универсального флуоресцентно-отражательного спектрометра “Skin-AGE”, предназначенного для решения различных биомедицинских задач, в том числе описанных выше.
1. Прибор “Skin-AGE”
1.1. Принцип действия
Для обеспечения универсальности в основу разработанного прибора – медицинского спектрометра “Skin-AGE”, положен способ локальной спектроскопии, осуществленный с помощью волоконного многоканального спектрометра. Известно, что в случае исследования кожи точечные измерения дают большой разброс показаний, обусловленный изменениями локальных оптических свойств ткани.
На рис. 3а показано изменение сигнала флуоресценции, полученное при перемещении волоконного зонда “Skin-AGE” в пределах участка кожи 9,5×13,5 мм, а на рис. 3б – фотография этого же участка в свете собственной флуоресценции, полученная в свете АФ с помощью видеодерматоскопа “EcoSkin” [24]. Их сопоставление показывает, что основной причиной вариации сигнала флуоресценции является неравномерность пигментации кожи. Даже на таком относительно однородном незагорелом участке кожи среднеквадратическое отклонение сигнала (ско) составляет 13%. При
58 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
Интенсивность, усл. ед.
(а) 200
160 120 80 40
00
(б)
20 40 60 80 100 120 140
Время, с
1 мм
Рис. 3. Сигнал флуоресценции незагорелого участка кожи (третий фототип), полученный при его сканировании зондом спектрометра “Skin-AGE” (а), и фотография этого же участка предплечья (9,5×13,5 мм), полученная в свете автофлуоресценции с помощью видеодерматоскопа “EcoSkin” (б).
наличии в зоне измерения загара, пигментных пятен, волосяных фолликулов, волос и других элементов кожи этот разброс может быть значительно выше. Его можно уменьшить почти вдвое, если проводить, как это часто делается, нормировку флуоресценции по отражению (т. е. в качестве измеряемого параметра использовать отношение сигнала флуоресценции к сигналу, полученному в результате отражения возбуждающего излучения). Однако для надежной диагностики этого приема недостаточно.
Радикальным средством улучшения воспроизводимости данных является усреднение показаний на возможно большей площади. При наличии ручного зонда увеличение площади измерения достигается легко при сканировании поверхности кожи. Как будет показано ниже, эта мера вместе с выбором для измерения наиболее однородного участка кожи позволяет получать высокую сходимость результатов. Таким образом, основной методической
особенностью работы прибора “Skin-AGE” при измерениях на коже является использование усредненных данных, полученных в результате ее сканирования на большой площади.
Что касается аппаратных особенностей “Skin-AGE”, то одна из них заключается в быстром периодическом переключении режимов работы прибора с регистрации флуоресценции на регистрацию отражения и обратно. Это позволяет регистрировать оба типа спектров почти одновременно, что в свою очередь сводит до минимума ошибки, связанные с влиянием динамики кровотока.
Другая особенность обусловлена конструкцией зонда. В нем одни и те же волокна используются как при флуоресцентных, так и при измерениях отражения, а их дистальные торцы приводятся в непосредственный контакт с исследуемой поверхностью органа. Такая геометрия освещения и сбора света дает следующие преимущества. Она позволяет, во-первых, устранить зеркальную составляющую отражения, вносящую помеху при измерениях диффузного отражения, во-вторых, сделать идентичными траектории измеряемых флуоресцентных и рассеянных фотонов, что способствует повышению эффективности борьбы с влиянием поглощения кожи на флуоресцентный сигнал и, наконец, в-третьих, зондировать в основном эпидермис и верхний слой дермы, что важно для совместной оценки AGE и NADH.
Для оптимизации выполнения других задач предусмотрена возможность использования зондов иной конструкции.
Наконец, последней особенностью является использование для возбуждения флуоресценции ближней УФ области в диапазоне 360– 370 нм, которая является оптимальной для измерения AGE и NADH и в то же время позволяет измерять спектры флуоресценции многих других веществ, в том числе распространенных фотосенсибилизаторов.
Функциональная схема прибора “Skin-AGE” представлена на рис. 4. Для освещения объекта используется комбинированный осветитель, способный генерировать одновременно широкополосное видимое и УФ излучения. Их объединение в осветительном жгуте осуществляется на принципе углового суммирования излучений от различных источников света [25]. Осветитель включает в себя светодиод УФ свечения с длиной волны 365 нм (NC4U133A, Nichia), который предназначен для возбужде-
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
59
1 11
13 5
6
23 10
12
4 8
9
7
Рис. 4. Функциональная схема прибора “Skin-AGE”. 1 – комбинированный осветитель, 2 – УФ источник возбуждения флуоресценции, 3 – очищающий светофильтр, 4 – сопрягающая оптическая система, 5 – широкополосный источник видимого освета, 6 – Y-образный волоконный зонд, 7 – объект, 8 – блокирующий светофильтр, 9 – спектрометр, 10 – драйвер, 11 – переключатель, 12 – компьютер, 13 – расположение волокон в зонде:
в центре приемное волокно, вокруг – освети-
тельные волокна.
ния флуоресценции, а также расположенные по окружности с наклоном относительно его оптической оси светодиоды (белый, 405, 505, 660 и 730 нм), предназначенные для освещения объекта при измерениях спектров отражения в широком спектральном диапазоне (380– 760 нм).
В переднем фокусе сопрягающей оптической системы находится излучающая поверхность УФ светодиода, а в заднем фокусе – торцы волокон осветительного жгута зонда. Коротковолновый светофильтр применен для очистки УФ излучения от следов видимого света. Мощность УФ излучения на выходе зонда составляет около 5 мВт, что достаточно для записи высококачественных спектров флуоресценции при времени интегрирования порядка 7 мс.
Оси светодиодов 5 расположены под углом 18° относительно оптической оси сопрягающей системы. Этот угол чуть меньше апертурного угла используемого волокна (20,5°), что позволяет только части (около 25%) излучения попасть в его сердцевину. Этого количества, однако, вполне хватает, чтобы получать близкие по значению сигналы флуоресценции и от-
раженного света. Светодиоды питаются драйвером через переключатель, работа которого синхронизирована с работой спектрометра. В режиме одновременных флуоресцентно-отражательных измерений переключение проводится с частотой около 30 Гц, которая достаточна, чтобы отслеживать изменения сигналов при распространении пульсовой волны.
Излучение от источника света поступает на объект через осветительный канал волоконного зонда, состоящего из шести расположенных по периферии одинаковых волокон, а вторичное излучение от объекта поступает в спектрометр по центральному волокну. Таким образом, вместо традиционно используемой геометрии, при которой свет поступает через центральное волокно, а собирается окружающими его волокнами, в данном случае применяется обратная схема. Это позволяет увеличить интенсивность освещения и улучшить сбор света на фотоприемнике. Кварцевые волокна имеют числовую апертуру 0,35 и диаметр сердцевины 400 мкм.
В качестве спектрометра используется коммерчески доступный оптоволоконный спектрометр AvaSpec-2048 (Avantes Inc., Netherlands), построенный на основе полихроматора по симметричной схеме Черни–Тернера с линейным ПЗС в качестве фотоприемника. Прибор имеет 2048 элементов разложения размером 14×56 мкм и обеспечивает одновременную регистрацию спектров в области 330–1100 нм. В “Skin-AGE” из этой области используется диапазон 360–760 нм. С помощью входящей в состав спектрометра микропроцессорной платы проводится цифровое преобразование сигнала, его первичная обработка и передача в компьютер через интерфейс USB 2.0. На входе спектрометра установлен светофильтр, предназначенный для ослабления возбуждающего света, что важно при формировании нормирующего сигнала отражения в УФ области спектра.
Примеры спектров АФ и отражения, полученные у одного и того же человека на участках кожи с разной степенью загара, приведены на рис. 5. Видно, что по мере увеличения загара кривые отражения и флуоресценци смещаются вниз, причем у флуоресцентных спектров эта тенденция проявляется сильнее, чем у спектров отражения. Эти особенности приняты во внимание при выборе условий, снижающих влияние пигментации кожи (см. ниже).
60 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
Интенсивность АФ, усл. ед. R, %
70 760 50 40 30 20 10
0 350
380 400
440
1 2 3 4
56 78
450 500
550 l, нм
Рис. 5. Примеры спектрограмм, записанных прибором “Skin-AGE” на участках кожи (3-й
фототип) с различной степенью загара. Кривые 1–4 – спектры отражения (калибровка по МС-14). Кривые 5–8 – спектры АФ. 1, 5 – кожа без загара, 2, 6 – со слабым загаром, 3, 7 – с умеренным загаром, 4, 8 – с сильным за-
гаром. Пунктирными линиями показаны цен-
тры аналитических длин волн (380 и 440 нм)
при измерении AGE.
(а) (б)
1.2. Конструкция
Разработаны экспериментальные образцы прибора в двух вариантах исполнения – с внешним компьютером (а), со встроенным компьютером и дисплеем типа “touch screen” (б). Их внешний вид представлен на рис. 6. Запуск процесса измерения в первом варианте осуществляется с помощью кнопки, расположенной на дистальном конце зонда, а во втором – с помощью педали, подключенной непосредственно к прибору.
1.3. Стандарты и калибровка
Измерение флуоресцентных спектров проводится в радиометрическом режиме (“Irradiance Mode”), который позволяет записывать исправленные спектры флуоресценции в единицах спектральной плотности мощности излучения (мкВт/см2/нм) и получать результаты, не зависимые от времени интегрирования сигнала. Для этого прибор вместе с зондом проходит предварительную калибровку с помощью образцового источника “AvaLight-DH-Cal” (Avantes Inc., Netherlands). Периодический контроль и корректировка спектральных коэффициентов осуществляются с помощью флуоресцентного стандарта “USFS-200” (Labsphere Inc., USA).
Калибровка прибора в режиме отражения проводится с помощью пластины из молочно-
Рис. 6. Внешний вид экспериментальных образцов спектрометров “Skin-AGE” с внешним компьютером (a), со встроенным компьютером (б).
го стекла МС-14, приводимой в контакт с зондом. Спектры отражения кожи, показанные на рис. 5, заметно отличаются от измеренных с помощью интегрирующей сферы с калибровкой по стандартным образцам диффузного отражения [26]. Главное отличие состоит в бо′льших значениях коффициентов диффузного отражения в синей области спектра. Объясняется это главным образом различиями геометрии освещения и сбора света. Для целей диагностики эти различия несущественны. Наоборот свойственная “Skin-AGE” особенность регистрации спектра диффузного отражения с помощью того же зонда, что и спектра флуоресценции, способствует более эффективному устранению влияния пигментации
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
61
кожи. Если же требуются более правильные, с точки зрения метрологии, спектры диффузного отражения, то вместо волоконного зонда нужно использовать интегрирующую сферу, например “AvaSphere-30-REFL” (Avantes Inc., Netherlands), а в качестве образца сравнения – стандарт диффузного отражения “WS-2” (Labsphere Inc., USA).
2. Методика измерения на примере оценки AGE в коже
2.1. Выбор места и условий измерения
Предварительные исследования для выбора оптимального места измерения проводились на различных участках кожи (подушечка пальцев, ладонь, запястье, плечо, предплечье, локтевой сгиб, колено, голень, лодыжка) при вариациях ряда параметров измерений (площадь и время сканирования, давление на кожу и пр.).
Измерения показали, что все участки обладают статистически значимыми различиями средних величин. Более того, различия до 10% могут наблюдаться даже на идентичных у частках тела, расположенных с левой или с правой стороны. Поэтому для получения сопоставимых результатов необходимо не только зафиксировать место, но и сторону измерения (или пользоваться усредненными данными симметричных участков слева и справа). Наибольшую стабильность показаний дали измерения на коже медиальной поверхности плеча. При этом была получена сходимость результатов 1,6%. Измерения проводились в следующих условиях: регистрируемый параметр АФ – AF = F(440)/R(380), объект – незагорелый участок кожи 3-го фототипа, время от момента калибровки до конца измерения не более 30 мин, продолжительность сканированиях 3–5 с, площадь сканирования – 3–10 см2, спектральные условия регистрации сигналов – 380 ± 10 нм и 440 ± 10 нм.
2.2. Выбор условий снижающих влияние пигментации кожи
Различный характер пигментации кожи может существенно дестабилизировать результаты измерений AGE, когда сравниваются данные, полученные у людей с разными цветом кожи или степенью загара.
Для уменьшения этого эффекта предложен ряд корректирующих технологий [27]. Как
указывалось выше, в приборе “AGE-Reader” результат измерения представляется в виде нормализованной на отражение интенсивности АФ. Такой коррекции оказалось недостаточно для проведения измерений у людей с разным цветом кожи [28]. Для снижения этого влияния предложено использовать корректирующую функцию, рассчитываемую из спектров отражения, которая дала для европеоидной группы снижение разброса АФ с 20 до 14,8% ско [28].
В приборе “SCOUT” для коррекции используют другой подход, основанный на применении следующей эмпирической формулы [22]:
fxm = Fxm/(RxkxRmkm),
(1)
где Fxm – измеренный сигнал флуоресценции, fxm – скорректированный сигнал флуоресценции, Rx и Rm – коэффициенты отражения на длинах волн возбуждении и эмиссии, kx и km – показатели степени, устанавливаемые эмпирическим способом.
В настоящей работе были опробованы различные условия измерения и способы коррекции, позволяющие учесть потери света внутри ткани, вызванные поглощением и рассея нием фотонов при возбуждении и эмиссии. Они, в частности, показали, что при выборе длин волн, на которых осуществляются оценки ф луоресценции и отражения, желательно их устанавливать на спектральных участках с близкими значениями коэффициентов отражения. Как указывалось выше, максимум эмиссионного спектра AGE находится на длине волны 440 нм. Ближайшей точкой области возбуждения со сходным значением коэффициента отражения является 380 нм (рис. 5). Эти длины волн были выбраны в качестве аналитических.
В качестве функции корректированной флуоресценции исследовались различные зависимости. Наилучшие результаты были получены с формулой
AF = F(440)/[R(380)k1 + аR(440)k2], (2)
где F(440), R(380) и R(440) – соответственно флуоресцентный сигнал и отраженные сигналы на аналитических длинах волн, k1 и k2 и а – константы, устанавливаемые по резуль татам экспериментов.
Для подбора констант, обеспечивающих лучшую коррекцию, проводились исследования кожи одного и того же человека на участках с различной ее пигментацией. Такой ме-
62 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
тодический подход, по сравнению с измерениями кожи с различным цветом [29], существенно упрощает и ускоряет подбор оптимальных констант. Результаты одного из наших экспериментов, в котором измерения проводились на 4-х участках кожи плеча с разной степенью загара, представлены в табл. 1 и на рис. 7. Максимальные перепады флуоресцентного сигнала, вызванные различной пигментацией кожи, превышали 10 раз. Номера вариантов с различными значениями констант формулы (2) показаны в первом столбце табл. 1, а получаемый при этом разброс значений скорректированной АФ DAF – в последнем столбце т аблицы.
Из представленных данных видно, что отсутствие коррекции (вариант 1) приводит к наихудшим результатам. Разброс сигналов флуоресценции в этом случае для всех зон кожи с различной пигментацией составил 60,6% (ско). Намного лучше (18,3%) обстоит дело, когда в качестве измеряемого параметра используется отношение флуоресцентного сигнала к сигналу отражения в области возбуждения F(440)/R(380) (вариант 2). При слабой пигментации (R(380) > 40%) разброс составляет 1,6%. При использовании экспоненциальной функции F(440)/R(380)0,85 (вариант 3) аналогичный результат может быть достигнут при R(380) > 15–20%. Для того чтобы коррекция была эффективной во всем диапазоне возможных отражений (R(380) = 5–60%),
Таблица 1. Коррекция влияния пигментации кожи с помощью формулы (2) при различных зна-
чениях констант k1 и k2 и а
№ кривой k1
k2
а DAF(ско), %
1 0 0—
2 1 0—
3
0,85
0
—
4
0,40 0,54
0,5
60,6 18,3 5,6 1,1
Интенсивность АФ (440 нм), усл. ед.
1,4 4
1,2
1
0,8
0,6
Cн
0,4
3
2
Cр 1
Cл
Б
0,2
0 0 10 20 30 40 50 60
R (380 нм), %
Рис. 7. Результаты измерений АФ кожи при различных значениях констант k1 и k2 и а на медиальной части плеча на участках с различной степенью загара: без загара (Б), со слабым (Сл), средним (Ср) и сильным (Сн) загаром. Условия регистрации кривых 1–4 соответствуют значениям, приведенным в табл. 1.
требуется использовать данные об отражении также и на длине волны эмиссии. При подстановке в формулу (2) констант k1 = 0,4, k2 = 0,54, а = 0,5 (вариант 4) ско параметра AF в этом случае составило 1,1%. Таким образом, применение формулы (2) с указанными константами позволяет уменьшить вариацию AF по сравнению с полным отсутствием коррекции почти в 60 раз.
3. Примеры исследований
3.1. Оценка AGE в норме, при диабете и почечной недостаточности [28]
Контингент обследованных лиц состоял из четырех групп: практически здоровые мужчины и женщины (контроль), больные СД, пациенты с трансплантированной почкой (ТП), больные с хронической почечной недостаточностью (ХПН), находящиеся на программном гемодиализе.
Результаты измерений представлены в табл. 2. Значения АF получены путем коррек-
Таблица 2. Результаты исследований АФ кожи у здоровых лиц и при различной патологии
Группа
n Средний возраст (диапазон) AF (среднее/ско, %) Коррелляция с возрастом, %
контроль СД ТП гемодиализ при ХПН
47 20 21 81
38 (16–78) 56,1 (29–82) 43,5 (15–62) 53,4 (22–82)
1,00/14 1,22/11 1,33/20 1,56/29
74 60 53 14
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
63
ции данных по возрастной зависимости для контрольной группы и нормированы по отношению к ее среднему значению. Разброс данных внутри каждой группы указан в ско. Наибольшее увеличение АФ (1,56 ± 0,29) наблюдалось у больных с ХПН, находящихся на гемодиализе. Корреляция с возрастом у них практически отсутствует. Образование AGE при ХПН связано с прямым взаимодействием реактивных карбонильных групп с аминогруппами белков (карбонильный и оксидативный стрессы). Больные с ТП демонстрируют меньшую АФ по сравнению с ХПН (1,33 ± 0,20), что может свидетельствовать о процессе нормализации AGE после пересадки почки. Корреляция с возрастом у них занимает промежуточное положение между ХПН, контролем и СД (53%).
Что касается группы больных СД, то превышение АФ над нормой в среднем составило 22% при разбросе внутри группы 11%. Если за границу нормы принять значение 1,09, то чувствительность (Se) и специфичность (Sp) диагностики диабета по данным этой небольшой по численности выборки составила бы, соответственно, Se = 0,81 и Sp = 0,87.
Проведенные исследования показали удобство применения прибора в клинических условиях (рис. 8) и подтвердили известные из литературы закономерности изменения AGE в норме, а также при некоторых заболеваниях.
мии/реперфузии. Первые два интервала ишемии (каждый из них по 5 мин) использовались для достижения эффекта прекондиционирования, третий 10-мин цикл – для оценки полученного эффекта. Как видно из графика, индекс ишемии в третьем цикле уменьшился по сравнению с первым примерно на 20%, что свидетельствует о перестройке метаболических процессов в миокарде и достижении эффекта прекондиционирования.
Полученные результаты указывают на следующие возможные применения разработанного прибора в клинической практике: интраоперационный мониторинг адекватности защиты миокарда при проведении кардиоплегии, осуществление интраоперационной оценки адекватности перфузии миокарда в зоне реваскуляризации, оценка состояния сердца в момент изъятия у донора и перед проведением трансплантации.
3.2. Мониторинг NADH флуоресценции при ишемии/реперфузии сердца [30]
Целью исследования было изучение динамики АФ сердца в процессе выполнения повторных эпизодов кратковременной ишемии и реперфузии, известных под названием прекондиционирование (адаптивный феномен, заключающийся в повышении резистентности миокарда к последующей продолжительной ишемии). Опыты осуществлялись на изолированном перфузируемом по Лангендорфу сердце крысы. Измерения проводились на приборе “Skin-AGE” в режиме непрерывной регистрации интегральной интенсивности флуоресценции в максимуме эмиссии NADH на длине волны 450 ± 10 нм при возбуждении излучением длиной волны 365 нм. Щуп при регистрации находился в постоянном контакте с работающим сердцем.
На рис. 9 приведены результаты измерения в процессе выполнения трех циклов ише-
64
Индекс ишемии
Рис. 8. Проведение измерений АФ кожи у больных с ХПН с помощью прибора “Skin-
AGE” в Центре гемодиализа городской боль-
ницы № 31 Петербурга.
100
80
60
40
20 0
ишемия
реперфузия
0 500
1000
I цикл II цикл
1500 2000Время, с III цикл
Рис. 9. Изменения сигнала АФ изолированного сердца во времени, обусловленные измене-
нием концентрации NADH при циклической
тотальной ишемии/реперфузии.
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
3.3. Оценка АФ кожи при длительных регулярных наблюдениях
Цель наблюдений заключалась в проверке стабильности данных измерений АФ кожи при их регулярном проведении в течение длительного времени у одного и того же человека. Причина вариации показаний могла иметь техническую и биологическую природу. При регулярных измерениях (по 7–10 раз в день в определенном месте кожи в течение 58 суток) были выявлены обе составляющие. Приборная нестабильность объяснялась изменением температуры спектрометра в процессе его разогрева. Устранение этой причины позволило выявить статистически значимые отклонения в течение дня, связанные с изменением физиологического состояния организма.
Как видно из диаграммы, представленной на рис. 10, максимальные значения АФ наблюдаются в середине рабочего дня после обеда, а также при кратковременной физической нагрузке. При этом было замечено, что в отдельные особо напряженные рабочие дни, сопровождавшиеся изменением привычного ритма жизни, показания увеличивались на 17% относительно среднего уровня. Минимальные значения регистрировались ранним утром по окончании сна и после приема душа.
Причина таких изменений, по-видимому, связана с изменением уровня NADH в коже в течение дня. Как отмечалось выше, этот уровень зависит от окислительно-восстанови-
после сна после зарядки
после душа после завтрака
до обеда после обеда перед ужином после ужина перед сном
0,9 0,92 0,94 0,96 0,98 1,00 1,02 1,04 1,06
Рис. 10. Результаты регулярных измерений АФ кожи на внутренней стороне плеча у мужчины 70 лет в течение 58 суток. Измеряемый параметр – AF = F(440)/R(380). Показаны средние значения АФ, измеренные при идентичных событиях в течение дня. Горизонтальными линиями показаны доверительные интервалы средних значений при уровне значимости a = 0,05.
тельного состояния ткани и при недостатке кислорода в ткани АФ увеличивается. Для объяснения наблюдаемых закономерностей следует предположить, что в течение дня уровень насыщения кожи кислородом может существенно изменяться, что в свою очередь приводит к смещению равновесной реакции NAD+ ↔ NADH либо в сторону восстановления, либо окисления. Физическая нагрузка, утомление в течение рабочего дня способны сдвинуть состояние ткани в сторону восстановления и, наоборот, длительный отдых и водно-ги гиенические процедуры, способствующие насыщению ткани кислородом, – в сторону окисления. В случае подтверждения описанных эффектов можно рассчитывать на еще одно клиническое применение разработанного прибора, а именно, объективную оценку окислительно-восстановительного состояния организма в норме и при различных патологиях путем мониторинга NADH–АФ кожи.
Заключение
Прибор “Skin-AGE” позволяет решать ши рокий круг биомедицинских задач путем измерения спектров флуоресцентной эмиссии и диффузного отражения. С помощью волоконного щупа возможен доступ к различным участкам поверхности функционирующих органов, в том числе кожи.
Для возбуждения флуоресценции используется излучение с длиной волны 365 нм, которое подходит для возбуждения многих эндогенных и экзогенных флуорофоров, в том числе AGE и NADH, а также распространенных порфириновых и хлориновых фотосенсибилизаторов. Эффективное освещение и сбор света позволяют регистрировать спектры флуоресценции и отражения при времени накопления, не превышающем 10 мс. Благодаря практически одновременному измерению обоих типов спектров удается уменьшить влияние динамической компоненты ошибки.
Для снижения влияния пигментации на флуоресцентный сигнал разработан метод, позволяющий значительно уменьшить погрешность, вызванную изменениями концентрации меланина.
Особое внимание в работе уделено условиям получения стабильных результатов измерений, поскольку в задачах флуоресцентной диагностики, основанных на AGE и NADH, изменения обычно невелики и могут легко потонуть
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
65
в шумах, имеющих как биологическую, так и техническую природу. Принятые аппаратнометодические меры позволяют регистрировать небольшие изменения АФ кожи, что повышает надежность существующих методов диагностики и позволяет разрабатывать принци пиально новые.
Возможности прибора проиллюстрированы проведенными с его помощью биомедицинскими исследованиями. В одном из них были обнаружены закономерные изменения АФ в течение суток. Этот феномен может быть использован при разработке объективной методики для оценки степени утомления организма. Кроме того, его нужно принимать во внимание для стабилизации показаний при оценке AGE кожи.
Для дальнейшего расширения возможностей прибора в следующих его модификациях предполагается увеличить число длин волн возбуждения до 5.
Авторы благодарят проф. А.М. Есаяна, проф. Е.Н. Гриневу, Е.А. Трофимову, М.В. Вадюхину и А.Н. Нимгирову за организацию и участие в проведении клинических исследований по оценке AGE в норме, при диабете и почечной недостаточности.
Авторы также выражают благодарность Сеульскому городскому правительству и Сеульскому институту развития за поддержку данной работы в рамках международной программы “Inviting & Supporting Project of Global Leading Institutions” (funds WR100001 for Russian Science Seoul).
* * * * *
ЛИТЕРАТУРА
1. Оптическая биомедицинская диагностика. Т. 2 / Под ред. Тучина В.В. М.: Физматлит, 2007. 368 с.
2. Richards-Kortum R., Sevick-Muraca E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis // Annu. Rev. Phys. Chem. 1996.V. 47. P. 555–606.
3. Papayan G.V., Barsky I.Ya. Contact Luminescence spectrophotometry for biomedical studies // Proc. SPIE. 2001. V. 4515. P. 125–136.
4. Shahzad A., Koehler G. Fluorescence spectroscopy: An emerging excellent diagnostic tool in Medical Sciences // The Internet Journal of Medical Technology. 2010. V. 5. № 1.
5. Ramanujam N., Mitchell M.F., Mahadevan A., Thomsen S., Silva E., Richards-Kortum R. Fluorescence spectroscopy: A diagnostic tool for cervical intraepithelial neoplasia // Gynecol. Oncol. 1994. V. 52. P. 31–38.
6. Mitchell M., Cantor S.B., Brookner C., Utzinger U., Schottenfeld D. Fluorescence spectroscopy for diagnosis of squamous intraepithelial lesions of the cervix // Obstet. Gynecol. 1999. V. 93. № 3. P. 462–470
7. Chang S.K., Mirabal Y.N., Atkinson E.N., Cox D., Malpica A., Follen M., Richards-Kortum R. Combined reflectance and fluorescence spectroscopy for in vivo detection of cervical pre-cancer // Journal of Biomedical Optics. 2005. V. 10. № 2. P. 024031-1–024031-11.
8. Zuluaga A., Utzinger U., Durkin A., Fuchs H., Gillenwater A., Jacob R., Kemp B., Fan J., Richards-Kortum R. Fluorescence excitation-emission matrices of human tissue: a system for in vivo measurement and data analysis // Appl. Spectrosc. 1999. V. 53. P. 302–311.
9. Loschenov V.B., Konov V.I., Prokhorov A.M. Photodynamic therapy and fluorescence diagnostics // Laser Physics. 2000. V. 10. № 6. P. 1188–1207.
10. Zharkova N.N., Kozlov D.N., Polivanov Yu.N., Pykhov R.L., Smirnov V.V. Laser-excited fluorescence spectrometric system for tissue diagnostics // Proc. SPIE. 1994. V. 2328. P. 196–201.
11. Horvath K.A., Schomacker K.T., Lee C.C., Cohn L.H. Intraoperative myocardial ischemia detection with laserinduced fluorescence // J. Thorac. Cardiovasс. Surg. 1994. V. 107. P. 220–225.
12. Mayevsky A., Rogatsky G.G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies // Am. J. Physiol. Cell. 2007. V. 292. P. 615–640.
13. Beránek M., Nováková D., Rozsíval P., Drsata J., Palicka V. Glycation and advanced glycation end-products in laboratory experiments in vivo and in vitro // Acta medica (Hradec Kralove). 2006. V. 49. № 1. P. 35–39.
14. Graaff R., Meerwaldt R., Lutgers H., Baptist R., de Jong E., Andries T., Smit L., Rakhorst G. Instrumentation for the measurement of autofluorescence in human skin // Proc. SPIE. 2005. V. 5692. P. 111–118.
66 “Оптический журнал”, 80, 1, 2013
15. Lutgers H.L., Graaff R., Links T.P., Ubink-Veltmaat L.J., Bilo H.J., Gans R.O., Smit A.J. Skin autofluorescence as a noninvasive marker of vascular damage in patients with type 2 diabetes // Diabetes Care. 2006. V. 29. № 12. P. 2654–2659.
16. Meervaldt R., Lutgers H.L., Links T.P., Graaff R., Baynes J.W., Gans R., Smit A.J. Skin AF is a strong predictor of cardiac mortality in Diabetes // Diabetes Care. 2007. V. 30. P. 107–112.
17. Hartog J.W, Gross S., Oterdoom L.H., van Ree R.M., de Vries A.P., Smit A.J., Schouten J.P., Nawroth P.P., Gans R.O., van Son W.J., Bierhaus A., Bakker S.J. Skin autofluorescence is an independent predictor of graft loss in renal transplant recipients // Transplantation. 2009. V. 87. № 7. P. 1069–1077.
18. Meerwaldt R., Links T.P., Graaff R., Hoogenberg K., Lefrandt J.D., Baynes J.W., Gans R.O., Smit A.J. Increased accumulation of skin advanced glycation end-products precedes and correlates with clinical manifestation of diabetic neuropathy // Diabetologia. 2005. V. 48. P. 1637–1644.
19. Goldin A., Beckman J.A., Schmidt A.M., Creager M.A. Advanced glycation end products sparking the development of diabetic vascular injury // Circulation. 2006. V. 114. P. 597–605.
20. Meerwaldt R., Hartog J.W., Graaff R., Huisman R.J., Links T.P., den Hollander N.C., Thorpe S.R., Baynes J.W., Navis G., Gans R.O., Smit A.J. Skin autofluorescence, a measure of cumulative metabolic stress and advanced glycation end products mortality in hemodialysis patients // J. Am. Soc. Nephrol. 2005. V. 16. P. 3687–3693.
21. Ediger M.N., Johnson R.D., Hull E.L., Brown C.D. Determination of a measure a glycation end-products or disease state using tissue fluorescence // Patent US. № 8078243. 2011.
22. Hull E., Ediger M., Unione A., Deemer E., Stroman M., Baynes J. Noninvasive, optical detection of diabetes: model studies with porcine skin // Opt. Exp. 2004. V. 12. P. 4496–4510.
23. Maynard J.D., Rohrscheib M., Way J.F., Nguyen C.M., Ediger M.N. Noninvasive type 2 diabetes screening, superior sensitivity to fasting plasma glucose and A1C // Diabetes Care. 2007. V. 30. P. 1120–1124.
24. Kang Uk, Папаян Г.В., Bae Soo-Jin, Березин В.Б., Ким С. Флуоресцентный видеодерматоскоп // Оптический журнал. 2008. Т. 75. № 1. С. 32–38.
25. Kang Uk, Папаян Г.В., Макаров Д.А., Lee Seung Yup, Bae Su Jin. Осветитель для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики со световодным выводом излучения // Оптический журнал. 2008. Т. 75. № 12. С. 16–22.
26. Kim O., McMurdy J., Lines C., Duffy S., Crawford G., Alber M. Reflectance spectrometry of normal and bruised human skins: experiments and modeling // Physiol. Meas. 2012. V. 33. P. 159.
27. Bradley R.S., Thorniley M.S. A review of attenuation correction techniques for tissue fluorescence // J. R. Soc. Interface. 2006. V. 3. P. 1–13.
28. Koetsier M., Nur E., Chunmao H., Lutgers H.L., Links T.P., Smit A.J., Rakhorst G., Graaff R. Skin color independent assessment of aging using skin autofluorescence // Opt. Exp. 2010. V. 18. № 14. P. 14416–14429.
29. Петрищев Н.Н., Папаян Г.В., Есаян А.М., Гринева Е.Н., Kang Uk. Исследование конечных продуктов гликирования методом флуоресцентной спектроскопии кожи. Фотодинамическая терапия и флуоресцентная диагностика // Сб. научных трудов / Под ред. Петрищева Н.Н. СПб.: Лань, 2011. С. 222–230.
30. Петрищев Н.Н., Папаян Г.В. Автофлуоресцентная органоскопия. Фотодинамическая терапия и флуоресцентная диагностика // Сб. научных трудов / Под ред. Петрищева Н.Н. СПб.: Лань, 2011. С. 261–273.
“Оптический журнал”, 80, 1, 2013
67